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劃重點(diǎn):細(xì)胞培養(yǎng)該如何應(yīng)對(duì)支原體污染!

更新時(shí)間:2021-10-15  |  點(diǎn)擊率:636
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)現(xiàn),使得很多研究不必局限于在動(dòng)物或人體內(nèi)進(jìn)行,試驗(yàn)環(huán)境更為簡(jiǎn)單,目的更為明確,如:細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的基礎(chǔ)研究;細(xì)胞與細(xì)胞相互作用;細(xì)胞與環(huán)境間的相互作用;遺傳學(xué)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化;細(xì)胞產(chǎn)物和分泌等等。

細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染是極普遍的問(wèn)題,面對(duì)支原體污染給細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)的巨大難題,世界各國(guó)開(kāi)始重視,并相繼建立了細(xì)胞庫(kù),對(duì)細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)展控制,效guo顯著,支原體污染的問(wèn)題得以限制。目前已知能污染細(xì)胞的支原體有20多種以上,其中95%以上的支原體污染是口腔支原體。

支原體是目前已知一類能在無(wú)生命培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的最小的原核細(xì)胞微生物,分為兩個(gè)屬:一為支原體屬(Mycoplasma),有幾十個(gè)種;另一為脲原體屬(Ureaplasma),僅有一種。革蘭染色為陰性,但不易著色,一般用Giemsa染色,染成淡紫色。

支原體的污染來(lái)源

(1)細(xì)胞之間交叉污染;

(2)細(xì)胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等;

(3)工作環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的污染;

(4)培養(yǎng)基的污染。

支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中,主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預(yù)防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作;細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無(wú)菌;在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測(cè)

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記,使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件,進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),簡(jiǎn)稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn):①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短,2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測(cè)結(jié)果可定量。

④操作簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn):①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。(可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證)

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒(均為探針?lè)z測(cè)),依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別,

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗(yàn)臺(tái)、超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染,可引起細(xì)胞的污染。應(yīng)定期對(duì)工作區(qū)域進(jìn)行消毒。

德國(guó)MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑,或濕巾擦拭 5-10分鐘清除,對(duì)支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無(wú)殘留, 無(wú)腐蝕, 無(wú)致癌性,操作簡(jiǎn)單方便。

截圖20211015090715.png

qPCR法介紹:

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記,使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件,進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),簡(jiǎn)稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn):①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短,2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測(cè)結(jié)果可定量。

④操作簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn):①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。(可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證)

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。


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