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如何檢測你的細(xì)胞是否收到支原體的入侵呢?

更新時(shí)間:2022-08-19  |  點(diǎn)擊率:653

細(xì)胞培養(yǎng)被支原體污染是個(gè)世界性問題,在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%。支原體是一類無細(xì)胞壁,形態(tài)呈高度多形性,為圓形、絲狀或梨形,其直徑僅有0.13~0.18μm,變形能力大,故能通過濾菌器,突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁,對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明,支原體能耗盡營養(yǎng)物,促進(jìn)代謝積累,導(dǎo)致pH改變,對細(xì)胞造成多種影響,包括生長狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細(xì)胞存活等多方面的改變,繼而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,或造成無法解釋的差異。更加不幸的是拯救被感染的細(xì)胞幾乎是不可能的。

那如何檢測你的細(xì)胞是否收到支原體的入侵呢?下面介紹了幾種檢測方式,或許對你的實(shí)驗(yàn)有用。

分離培養(yǎng)法

分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標(biāo)方法,其檢測精確度*高。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣,并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會(huì)在這種瓊脂平板上生長,最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果,因此被譽(yù)為支原體檢測金標(biāo)準(zhǔn)。

但是,分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端,一是檢測時(shí)間太長,支原體要長出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類,分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候,例如支原體M. hyorhinis。

DNA檢測法,也稱直接培養(yǎng)法

將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng),一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞,如果原樣本中含有支原體,那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料(如Hoechst染料)染色時(shí),就可以在指示細(xì)胞的核周圍觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。

但是這種方法靈敏度太低,當(dāng)檢測成陽性時(shí),細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。且Hoechst熒光染色:操作復(fù)雜,操作不當(dāng)易造成假陽性或假陰性。

PCR法

市面上有許多商機(jī)提供基于PCR的支原體檢測試劑盒,如GeneCopoeia。這種方法已經(jīng)比較成熟,應(yīng)用的范圍也較為廣泛。

PCR法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本,其PCR引物可特異擴(kuò)增支原體基因組中rDNA保守序列,包括所有已知的支原體,及細(xì)胞培養(yǎng)過程普遍遇到的種屬,例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝膠電泳過程中,支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶,以此指示支原體的存在。

PCR法快速,簡便,具有強(qiáng)擴(kuò)增能力和很高的敏感性,可以檢測大多數(shù)支原體,但謹(jǐn)慎起見最好同時(shí)使用另一種檢測方法來進(jìn)行驗(yàn)證。PCR法檢測支原體只需幾個(gè)小時(shí),是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法。

酶學(xué)檢測

酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中,在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP,隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。

最后,建議你進(jìn)行定期檢測

支原體感染會(huì)影響細(xì)胞的正常生長,因此對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個(gè)月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅(jiān)持下去,是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。

通常來說,被污染的細(xì)胞應(yīng)該丟棄,以避免成為污染源。但對于珍貴的細(xì)胞,以往別的品牌的支原體清除劑,其實(shí)只是抑制劑,它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成,但無法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌,可與支原體膜特異性結(jié)合,破壞膜通透性,導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。

 

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