細(xì)胞培養(yǎng)的本質(zhì)是細(xì)胞克隆技術(shù)。原理就是盡可能給細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的環(huán)境，在無菌條件下，給予適當(dāng)?shù)臏囟群退釅A度以及細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必要的營養(yǎng)條件，使其能在體外維持正常的生長(zhǎng)繁殖，并保持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，抗體制備，新藥篩選，基因工程等等都需要用到細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

但在日常的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常會(huì)遇到一些問題，今天我們就這些常見的問題給出相應(yīng)的建議，希望對(duì)小伙伴們有所幫助。

貼壁細(xì)胞如何高效傳代？

貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿長(zhǎng)至單層鋪滿的狀態(tài)后后，空間已基本上飽和，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖受阻，為使其繼續(xù)擴(kuò)增或生長(zhǎng)，需要進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）處理。同時(shí)，傳代培養(yǎng)也可用于細(xì)胞種的保存。不僅如此，各種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也是以高效的細(xì)胞傳代為基礎(chǔ)的。

懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞則需經(jīng)消化等處理后才能分瓶。

一般使用胰蛋白酶，將貼壁細(xì)胞消化成成單個(gè)細(xì)胞，也可加入EDTA提高消化能力（EDTA 是一種二價(jià)離子的螯合劑，能抑制細(xì)胞膜上的Ca2+和Mg2+）。

常用的細(xì)胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，先用吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS清洗細(xì)胞，棄掉洗滌液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根據(jù)培養(yǎng)皿的大小不同，一般2-5ml消化液即可，以剛好鋪滿整個(gè)皿底為原則)，觀察細(xì)胞直到細(xì)胞變圓脫離瓶壁，此過程一般需要3-5分鐘，為了避免細(xì)胞成團(tuán)，消化細(xì)胞的過程中不要拍打細(xì)胞瓶。對(duì)于特別難消化的細(xì)胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細(xì)胞置于37°C 促進(jìn)消化，細(xì)胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的*培養(yǎng)基中止消化。

800-1000rpm，離心5分鐘，然后棄去中止用的培養(yǎng)基，加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞，移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細(xì)胞類型而定。胰蛋白酶會(huì)對(duì)某些細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，對(duì)于這種類型的細(xì)胞，可用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細(xì)胞，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代的頻率為多久？

貼壁型的細(xì)胞的匯合度約為100%的時(shí)候，需進(jìn)行傳代操作。

當(dāng)細(xì)胞以克隆的形式生長(zhǎng)時(shí)，匯合度則達(dá)不到100%。對(duì)于該類型的細(xì)胞，達(dá)到或者接近最大密度的時(shí)候，即觀察不到細(xì)胞明顯擴(kuò)增時(shí)，就需要進(jìn)行傳代。

接觸抑制型細(xì)胞需要在細(xì)胞長(zhǎng)滿之前傳代，避免產(chǎn)生細(xì)胞長(zhǎng)滿后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。

懸浮型的細(xì)胞必須在細(xì)胞達(dá)到最大飽和密度之前傳代，懸浮細(xì)胞傳代時(shí)只需稀釋至合適的密度，讓細(xì)胞有充足的營養(yǎng)恢復(fù)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

如何處理腫瘤細(xì)胞株？

了解每株細(xì)胞可能產(chǎn)生的生物危害是很難的。

• 強(qiáng)烈推薦，所有的人類和其他靈長(zhǎng)類生物的細(xì)胞在預(yù)防HIV和肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)條件下操作；

• 所有的操作必須在生物安全柜中操作，遵守生物安全柜使用規(guī)范；

• 操作過程中產(chǎn)生的廢液和廢儀器都要經(jīng)過清洗、酸處理等處理后才能丟棄。